Wissensdatenbank - Glossar

• PCR
  PCR engl. steht für polymerase chain reaction. Die Polymerase Kettenreaktion ist eine biochemische Methode, die mit Hilfe einer hitzestabilen Polymerase und zwei Sequenz-spezifischen Primern aus einer Mischung an DNA-Fragment ein spezifisches Zielfragment herausamplifizieren (vermehren) kann, um genügend Material für weitere Analysen zu erhalten.
• Primer
  Primer englisch, deutsch Starter, sind kurze einzelsträngige Oligonucleotide, die als spezifische Startpunkte für den Beginn der Replikation durch eine DNA-Polymerase oder die Umschreibung von RNA in cDNA durch eine Reverse Transcriptase in der Bioanalytik dienen (PCR).
   
• Puffer
  Puffer sind Mischungen aus einer Säure und einer Base, die einen stabilen pH Wert für biochemische Reaktionen sicherstellen.
• Magnesium
  Magnesium als zweiwertiges Kation in biochemischen Reaktionen als Cofaktor notwendig. In der Biochemie für DNAsen und für Polymerasen und im PCR insbesondere noch für die Stabilität der Primer-Bindung notwendig.
   
• Taq-Polymerase
  Taq-Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase isoliert aus Thermus aquaticus, zentrales Enzym der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
   
• Taq
  Laborjargon "die Taq", für Taq-Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase isoliert aus Thermus aquaticus, zentrales Enzym der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
   
• Wasser
  Wasser besser Wasser für die Molekularbiologie, DNA-, DNase- und RNase-freies destilliertes oder entsalzenes Wasser.
   
• Template
  Template englisch und deutsch, bedeutet Vorlage oder Matrize und bezeichnet die Ausgangs-DNA als Vorlage für die PCR-Amplifikation.
• dNTPs
  dNTPs: Abkürzung für Desoxynucleosidtriphosphate: Sammelbegriff für die im PCR benutzten vier Nucleotide dATP-Desoxyadenosintriphosphat, dGTP Desoxyguanosintriphosphat, dTTP Desoxythymidintriphosphat, dCTP Desoxycytosintriphosphat. 
   
• real-time PCR
  Ist eine PCR-Methode, bei den man die Amplifikation der Produktmenge mittels DNA-bindenden  Fluoreszenz-Farbstoffen über die Zeit, von Cyclus zu Cyclus, beobachten kann. Der Fluoreszenzanstieg (Anstieg der Produktmenge) kann genutzt werden, um die Template Menge zu bestimmen, qPCR, quantitative PCR. Der Verlust von Fluoreszenz während einer Hitzedenaturierung des PCR-Produktes führt zu einer Schmelzkurve, die Aussagen über die relative Basenzusammensetzung des Amplikons gibt und zur Typisierung genutzt werden kann. 
   
• qPCR
  Bezeichnet eine real-Time PCR, die für die Quantifizierung der Templatemenge eingesetzt wird. 
• SYBR-Green
  Ist ein Doppelstrang-DNA-bindender Farbstoff, der genutzt wird, um die Menge PCR-Produkt in einer real-time PCR zu messen und über eine Schmelzkurvenanalyse Informationen über die Basenzusammensetzung des Amplikons zu erhalten.
• Eva-Green
  Ein grün fluoreszierender Farbstoff, der durch seine Bindestärke an Doppelstrang-DNA zum Nachweis von PCR-Produkt in der real-time PCR mit Schmelzkurven-Analyse genutzt wird.
   
• Ct
  Cycle Threshold bezeichnet den Cyclus in einer real-time PCR bei dem der Fluoreszenzwert (proportional der PCR-Produkt-Menge) eine Intensitätsschwelle (Threshold) überschreitet. Er wird genutzt, um die Template-Menge zu quantifizieren. 
   
• C0t
  Cycle Threshold am 0-Wert, bezeichnte den Cyclus in einer real-time PCR bei dem der Fluoreszenzwert (proportional zur PCR-Produkt-Menge) eine Intensitätsschwelle (Threshold) überschreitet. In diesem Fall den 0-Wert der Fluoreszenz also die Basislinie. Er wird genutzt um die Template-Menge zu quantifizieren. 
   
   
• Cq
  Quantifizierungs Cycle bezeichnte den Cyclus in einer real-time PCR bei dem der Fluoreszenzwert (proportional zur PCR-Produkt-Menge) eine Intensitätsschwelle (Threshold) überschreitet und der genutzt wird für die Quantifizierung der Template-Menge. Um dies zu markieren wird der Ct-Wert meist auch als Cq bezeichnet.
• Threshold Setting
  Bezeichnet das Verfahren mit dem der Threshold, Schwellenwert, festgelegt wird. Unterschiedliche Geräte, Analyse-Programme und Fragestellungen des Exprimentes haben unterschiedliche Regeln den Threshod zu setzen.
• Baseline Setting
  Bezeichnet das Verfahren mit dem die Basislinie einer real-Time PCR gesetzt wird. Wichtig ist wie lange, d. h. über wieviele Cyclen die Werte der Grundfluoreszenz in die Normalisierung einbezogen werden, meist 10 bis 15 Cyclen.
   
• Fluoreszenz-Wert
  In der real-Time PCR ist der Fluoreszenswert der auf der Y-Achse gegen die X-Achse aufgetragene Messwert der Fluoreszenz die entsteht, wenn ein Fluoreszenzfarbstoff an dsDNA (PCR-Produkt) bindet.
   
• Taqman-Sonde
  Taqman-Sonde auch als Hydrolysis-Sonde bezeichnet, zeigt nach Bindung an der Ziel-DNA-Sequenz durch Hydrolyse der Sonde mit Hilfe der Taq-Polymerase (bei 60 °C) eine Fluoreszenz-Emission.
• Hydrolysis-Sonde
  Hydrolysis-Sonde auch als Taqman-Sonde bezeichnet, zeigt nach Bindung an der Ziel-DNA-Sequenz durch Hydrolyse der Sonde mit Hilfe der Taq-Polymerase (bei 60 °C) eine Fluoreszenz-Emission.
• Molecular Beacon
  Sind Fluoreszenz-Quencher markierte Hybridisierungssonden, die am 5'-Ende (Fluorophor) eine 5 oder 7 Nucleotide langen CG-reiche DNA-Sequenz haben, die reverse -komplementär zur ebensolangen Sequenz am 3'-Ende mit dem Quencher ist. Beide Sequenzen sind unspezifisch und dienen dazu die beiden Fluorophor und Quencher durch ihre Wasserstoffbrückenbindung zusammenzuhalten und damit das Signal auszulöschen. Der Sequenz-spezifische Mittelteil der Sonde sorgt für einen Abstand zwischen Fluorophor und Quencher sobald die Sonde an der Ziel-DNA bindet und ermöglichst damit einer Lichtemission.  
   
• Quencher
  Eine Substanz, die das Fluoreszenz-Emissionslicht eines Fluorophors durch Absorption auslöschen oder modifizieren kann. Der Fluorophor-Quencher Mechanismus wird bei der Detektion der Sondenbindung an die Amplikon-DNA in der real-time PCR angewandt.
• LUX-Primer
  Lux steht für Light upon extension und bezeichnet Fluoreszenz-markierte Primer, die im ungebundenen Zustand so gefaltet sind, dass das 3'-Ende mit dem reverse komplementären 5'-Ende hybridisierte. Dadurch wird das Fluoreszenz-Signal reduziert (ge-quenched) und erst im verlängerten (light UponExtension) Zustand kann das Fluorohor sein Licht emittieren. Der 3'-Teil des Primer ist spezifisch, wohingegen ca.: 5 bis 7 Nucleotide des 5'-Endes eine reverse-komplementäre Sequenzwiederholung der 3'-Sequenz ist.
• SSBP
  Single Strand Binding Proteine (SSBP) halten den Doppelstrang während der DNA-Replikation offen und können im PCR als Additiv zur Verbesserung der PCR-Effizienz genutzt werden.
• Additive
  Sind Zusätze in der PCR, die das Aufschmelzen der Template-DNA (dsDNA) unterstützen, Inhibitoren neutralisieren, Polymerasen aktivieren, Primer-Bindung stabilisieren oder ähnliche Funktionen haben um das PCR zu verbessern
• Topoisomerase
  Topoisomerasen sind Enzyme der DNA-Replikation, die die Verdrilllung (Topologie) der DNA regulieren. Sie können, entweder einen Strang oder beide Stränge aufschneiden, die DNA entdrillt sich und die Stränge wieder verbinden.
   
• DNA-Helicase
  DNA-Helicasen sind Enzyme der DNA-Replikation, Genregulation und Reparatur, die die Spiralisierung der dsDNA unter ATP-Verbrauch öffnen können.
   
• Replikationsgabel
  Bezeichnet die gabelförmige Aufspaltung der dsDNA als Vorbereitung für die Replikation der DNA in der Zelle.
• Absolute Quantifizierung
  Unter absoluter Quantifizierung versteht man in der qPCR die Bestimmung der Kopienzahl der Template-Moleküle meist mittels einer Standard-Kurve. Die Einheit kann  sein Template-Kopien, GU, Bakterien-Zahl, Zell-Zahl oder Virionen-Zahl etc.). Kritiker und Freunde der Digital-PCR bemerken hier zu Recht, dass es sich wegen der Rückführung auf einen Größenstandard dennoch nur um eine relative (zum Standard) Quantifizierung handelt.